原代心肌細胞培養(yǎng)是體外研究心血管疾病相關(guān)機制的主要手段和基本技術(shù)?；A(chǔ)實驗中，與細胞系相比，原代心肌細胞的形態(tài)及電生理方面更接近在體細胞，因此，培養(yǎng)原代心肌細胞的質(zhì)量直接關(guān)系實驗的進程及結(jié)果。 材料與方法
1.實驗動物和主要試劑
1）新生24h內(nèi)的SD大鼠10只，雌雄不限；
2）DMEM高糖培養(yǎng)基（CellMax）；
3）胎牛血清（CellMax）；
4）胰蛋白酶（CellMax）；
5）雙抗（CellMax）；
6）D-Hanks；
7）5-溴脫氧尿嘧啶核苷
(5-Bromoo2'-deoxyuridine，5-Brdu)；
8）臺盼藍等。
2.主要實驗儀器
1）高性能無菌超凈臺；
2）CO2培養(yǎng)箱；
3）倒置相差顯微鏡；
4）離心機；
5）恒溫水浴鍋；
6）磁力攪拌器、
7）200目鋼網(wǎng)；
8）血細胞計數(shù)器、
9）解剖器械等。
注：
所有手術(shù)器械、離心管均高壓滅菌。
玻璃器皿用強酸浸泡過夜，流水沖洗10次，去離子水沖洗3次，烘干后高壓滅菌備用。
3.心肌細胞培養(yǎng)
新生24h內(nèi)的SD大鼠10只，體積分數(shù)為75％的乙醇浸泡消毒2遍，每次約8s。無菌眼科剪沿胸骨正中人剪，盡量避免剪破其他臟器產(chǎn)生污染。用無菌鑷子捏取心臟，迅速置于D-Hanks液中，仔細剝離大血管及多余組織，D-Hanks液反復(fù)認真沖洗至少3次，洗去殘留的血細胞及其他雜質(zhì)。
將心臟剪成約0.5mm×0.5mm×0.5mm的組織塊放人錐形瓶，加入10mL質(zhì)量分數(shù)為0.08％的胰蛋白酶封口，放入37℃水浴鍋中消化，轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速約90~100r·min-1。
第1次消化8min后靜置棄上清。剩余組織進行多次消化，每次2min，收集每次消化后的上清液，直至全部組織消化*。向上清液中加入體積約1/4~1/3的DMEM培養(yǎng)基（含15%的胎牛血清）以終止上清液中殘余胰蛋白酶的消化作用，防止損傷細胞，保證成活率。全部上清液以1200r·min-1離心12min，所得沉淀用約20mL培養(yǎng)基輕輕吹散，用移液管緩慢吹打均勻，細胞懸液經(jīng)200目孔徑鋼網(wǎng)過濾后移入培養(yǎng)瓶中進行差速貼壁（注意搖勻），55min后取細胞懸液以1000r·min-1離心10min，所得沉淀用培養(yǎng)基（pH=7.2）輕輕吹散。
根據(jù)臺盼藍染色結(jié)果及細胞計數(shù)結(jié)果調(diào)整細胞密度，以5×108L-1密度接種到培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中，放入37℃的溫箱中培養(yǎng)，24h后用D-Hanks液或磷酸鹽緩沖液輕輕沖洗去未貼壁的細胞，可得到視野清晰、密度均勻的貼壁心肌細胞。然后換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，72h再次換液，根據(jù)細胞生長狀態(tài)進行實驗。
4.心肌細胞質(zhì)量評價
1）心肌細胞觀察
倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)、生長狀態(tài)、搏動頻率、節(jié)律、強度，觀察培養(yǎng)液色澤變化以判斷心肌細胞生長是否良好。
2）臺盼藍拒染法計算細胞活力及細胞純度的鑒定
心肌細胞懸液用等量體積分數(shù)為0.4%臺盼藍溶液混勻后用血細胞計數(shù)板分別計數(shù)活細胞和死細胞數(shù)。鏡下死細胞染成藍色，活細胞拒染而呈透亮狀態(tài)。
細胞存活率=活細胞數(shù)/總細胞數(shù)（活細胞＋死細胞）×100%。
用免疫熒光法或通過細胞種板72h后計數(shù)搏動心肌細胞百分數(shù)測定心肌細胞純度。
心肌細胞免疫熒光鑒定
（1）在培養(yǎng)板中將已爬好細胞的玻片用PBS（0.01M）浸洗3次，每次3min；
?。?）用4%的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min；
（3）0.5%TritonX-100(PBS配制)室溫通透20min（細胞膜上表達的抗原省略此步驟）；
（4）PBS浸洗玻片3次，每次3min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫（6%山羊血清，不用BSA，PBS配置）封閉30min；
?。?）吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的ACTA1一抗（一抗?jié)舛龋?:20，一抗稀釋液：PBS配置）并放入濕盒，4℃孵育過夜；
?。?）37度復(fù)溫45min，加熒光二抗（二抗換成羊抗兔IgG（H+L)/RBITC,二抗?jié)舛龋?:200，二抗稀釋液：PBS配置）：PBS浸洗爬片3次，每次3min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中20-37℃孵育1h，PBS浸洗切片3次，每次3min；
注意：從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都盡量在較暗處進行。
?。?）復(fù)染核：滴加DAPI避光孵育5min，對標本進行染核，PBS5min×4次洗去多余的DAPI；
（8）用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后激光共聚焦拍照。
結(jié)果
1.心肌細胞形態(tài)觀察
心肌組織消化后所有心肌細胞均為圓形，培養(yǎng)2~3h部分細胞開始貼壁，12h后可見梭形細胞，細胞逐漸增大，部分貼壁的細胞出現(xiàn)自發(fā)性搏動；24h細胞幾乎全部貼壁，可見多角形細胞及較多細胞搏動；48h細胞形態(tài)為多角形或梭形，細胞伸出的偽足相互接觸交織成網(wǎng)，逐漸形成細胞簇或細胞單層，鋪滿瓶底。72h后99%以上細胞自律搏動，搏動頻率、節(jié)律、強度穩(wěn)定，頻率70~130次·min-1；大部分細胞相互連接，呈現(xiàn)同步搏動，同一培養(yǎng)瓶中細胞的搏動頻率一致。
24h心肌細胞
48h心肌細胞
2.心肌細胞活力測定結(jié)果臺盼藍染色顯示活細胞數(shù)>85%。
3.心肌細胞純度測定通過細胞種板72h后計數(shù)搏動心肌細胞百分數(shù)，所得心肌細胞純度>95%。
4.心肌細胞免疫熒光鑒定結(jié)果
心肌細胞（細胞核）
心肌細胞（ACTA1抗體表達）
心肌細胞（合成圖）
討論
1.鼠齡選擇多數(shù)文獻推薦1~3d大鼠，新生大鼠在出生后3d內(nèi)心肌細胞尚未分化，心肌細胞培養(yǎng)時成活率高。
通過大量實驗觀察認為最好選擇出生24h內(nèi)新生大鼠。
2.無菌操作防止污染是培養(yǎng)細胞成敗的關(guān)鍵之一。
常見為細菌、支原體等污染，可導(dǎo)致提取后的細胞不貼壁、不生長、生長后狀態(tài)不佳等。要嚴格執(zhí)行實驗室無菌操作規(guī)則且培養(yǎng)基中要加入終濃度為體積分數(shù)1%的雙抗液。
3.組織消化反復(fù)實驗顯示，0.5mmx0.5mmx0.5mm體積的組織塊更易快速消化且避免長時間消化給細胞帶來損傷。
常用消化液有胰蛋白酶及膠原酶I、Ⅱ等。胰蛋白酶濃度推薦質(zhì)量分數(shù)為0.060%-0.125%，膠原酶質(zhì)量分數(shù)為0.06%-0.10%。
單獨用質(zhì)量分數(shù)為0.08%胰蛋白酶較實用。消化過程應(yīng)在37℃下進行，用低速磁力攪拌器（80~100r·min-1）或手動搖晃及吹打使酶與組織充分混勻。
4.細胞洗滌;剛消化過的細胞本身附帶消化酶，不利于細胞貼壁，因此，至少要洗滌細胞2~3次。將收集好的上清液加入含體積分數(shù)15%胎牛血清的培養(yǎng)基以終止消化，然后離心細胞（1200r·min-1，12min）。
用培養(yǎng)基將離心后沉淀緩和吹散、混勻、過濾后再次離心（1000r·min-1，10min），如此重復(fù)1~2次，可洗去黏附細胞的消化酶，有利于細胞貼壁。
5.細胞純化：多選用差速貼壁分離法加化學(xué)抑制法。其原理是心臟組織消化后主要有2種細胞，即成纖維細胞和心肌細胞。
由于在培養(yǎng)瓶中大部分成纖維細胞能在短期內(nèi)貼壁（50~120min），而心肌細胞則需2~24h，因此，通過差速貼壁法能獲得較純的心肌細胞，約95%。差速貼壁分離細胞后，要在培養(yǎng)基中加入5-Brdu，終濃度為0.1mmol·L-1，目的是抑制成纖維細胞的生長。
6.細胞種植：細胞密度約5×108L-1時，72h后可見細胞伸展、接觸，細胞間進行信息交流，形成同步搏動;（1~3）×108L-1時可觀察單個細胞，可見到多種形態(tài)的細胞。
種植細胞24h后用磷酸鹽緩沖液或D-Hanks液輕輕洗滌培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶，洗去未貼壁細胞得到可供實驗的理想細胞。
